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人乳头瘤病毒与女性生殖道尖锐湿疣及亚临床感染的研究
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女性生殖道尖锐湿疣(condyloma
acuminata,CA)是由人乳头瘤病毒(human papilloma-virus,HPV)引起的一种性传播性疾病，其发病率正在逐年上升。然而，目前对该病的诊断仅限于临床观察和组织学检查，这使一些临床表现不典型的可疑病例确诊困难。我们应用聚合酶链反应(PCR)技术分别检测了湿疣组织、假性湿庞、生殖道其它良性病变以及正常阴道组织中HPV-DNA，通过对CA病人内裤及正常阴道拭子的HPV-DNA检测，探讨尖锐湿疣的传播途径。此外，还初步观察了雌激素受体(estrogen
receptor,ER)与 HPV 感染和 CA 发生的关系。
一、材料和方法
1.材料：
(1)生殖道组织HVP-NDA检测用标本取自下列人员：临床表现典型并经组织学检查证实的CA57例，临床表现不典型、组织学检查难以确诊的可疑 CA21 例，外阴假性湿庞 47例 ，宫颈糜烂 22 例，宫颈息肉21例，慢性阴道炎 25 例，生殖道正常妇女(取阴道组织)28例。取材量 20～100mg，放入 Eppendorff 管内，-40℃ 冰箱保存。
(2)拭子HPV-DNA检测用标本为经PCR检测证实为HPV6、11感染的19例CA病人的内裤(使用2～3天)拭子和50名正常妇女的阴道壁拭子。
(3)ER 检测用外阴组织标本取自下列人员：经组织学检查证实孕期外阴部CA17例，非孕期外阴部CA31例，外阴正常妇女11例。标本置 10% 甲醛中固定后，进行免疫组化染色。
2.HPV 寡聚核苷酸引物：由本室自行设计，北京公安部第七研究所合成。用于检测 HPV6、11、16、18等 40 余种 HPV 型别的 L1 区公共型引物(general primer,GP)简称 GP-HPV L1；用于检测 HPV6 和 11 型的 E6E7 区型别引物(Type-specific primer,TP)，简称 TP-HPV(6、11)E6E7。两对引物扩增片段长度分别为 450 和547 bp。
3.常规组织 NDA 提取按文献［1］方法进行。
4.PCR技术〔2〕：分为以组织 DNA 提取液为模板进行的各种组织 HPV-DNA 检测和以直接煮沸变性的拭子液为模板进行的各种拭子 HPV-DNA 检测，反应体系内同时含有 GP-HPVVL1 和 TP-HPV(6、11)E6E7两对引物。以 PBR 322 Hae Ⅲ 作 DNA 分子量标尺。
5.ER 免疫组织化学染色法；采用 ABC 法〔3〕标记，半定量分析法判定结果〔4〕。以磷酸缓冲液做雌激素抗体阴性对照。
二、结果
1.组织 HPV-DNA 检测：表1，图1
表1 生殖道各种良性病变及正常组织中
HPV-DNA 检出情况 病变种类 检测例数 GP-HPVL1 TP-HPV(6、11)E6E7 阳性数 % 阳性数 % 尖锐湿疣
57 56 98 48 86 假性湿疣 47 19* 40
5* 26 可疑息肉 21 15 21 12 80 宫颈息肉 21
16 76 8 50 宫颈糜烂 22 17 77 3
18 慢性阴道炎 23 4 16 1 1/4 正常阴道组织 28 3 11
0 * 与慢性阴道炎及正常阴道组织比，均P< 0.05 图1 女性生殖道 HPV 感染 PCR 检测结果
2.拭子 HPV-DNA 检测：50例正常妇女阴道拭子 GP-HPVL1 和 TP-HPV(6、11)E6E7阴性率分别为
54%(27/50)和7%(2/27)，19例外阴 CA 病人内裤拭子GP-HPVL1 和 TP-HPV(6、11)E6E7分别为74%(14/19)和64%(9/14)，图2。
图2 正常阴道拭子 HPV-DNA 检测
3.CA组织中 ER 检测：CA组织中 ER 几乎全部阳性，但孕期较非孕期 CA 的 ER 着色强度和阳性细胞比例都强和高；阳性颗粒主要分布于上皮的颗粒层和棘细胞层上2/3的胞核和(或)胞浆内。正常外阴组织中
ER 阳性很少，见表2。
表2 外阴部 CA 组织 ER 检测情况 标本 检测例数 ER阳性例数 棕黄色颗粒(%) 阳性细胞比例(%) 孕期CA
17 17 ＞80 80～96 非孕期CA 31 30 ＜30 22～48 正常外阴组织 11 1 ＜1 18
三、讨论
将两对引物同时加入PCR反应体系具有经济省时的特点，可同时进行HPV感染的检测和HPV型别的鉴定。将拭子直接煮沸变性放放上述循环中，省略了拭子DNA提取过程，并避免了DNA抽提时酚等有机溶机对PCR结果的影响，适于 HPV 感染的大范围普查。另外，本组 HPV-DNA 检出率说明，PCR 是检测CA中HPV-DNA敏感准确和可靠的方法，可弥补组织学诊断上的不足〔6〕，尤其适于可疑病例的确诊。
已知宫颈癌的发生与HPV16和18有关，而本研究中未采用HPV16和18引物，因此，HPV-DNA阳性而HPV6和11阴性的宫颈糜烂病例不能除外HPV16或18感染。由于从宫颈良性病变到非典型增生以至到原位癌是一个长期连续过程，故对此类病例应予重视。本组资料中，病因不明的假性湿疣
HPV 检出率虽不如 CA 高，高于正常阴道组织和慢性阴道炎(P< 0.05)，说明假性湿疣的发生与 HPV 感染有一定关系。
从CA病人内裤和正常妇女用阴道拭子中检出HPV提示性接触不是CA传播的唯一途径，CA病人污染的内裤可能是交叉或自身传染的传染源，也是 CA 治疗失败和复发的原因之一。
本组资料中CA组织ER几乎全部为阳性，孕期CA的阳性细胞比例和阳性颗粒强度都多于和强于非孕期CA。说明CA是ER依赖组织，而ER的分布特点恰好与组织学上的挖空细胞以及免疫组化和原位杂交显示的病毒颗粒存在的部位相吻合〔7，8〕，说明雌激素是HPV致病的重要辅助因素之一，CA 的发生与雌激素有关。
崔满华 郑鹏生 李守柔
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